Rolandas Maskoliūnas, LRT Televizijos laida „Mokslo ekspresas“, LRT.lt
2014 m. pabaigoje JAV mokslininkai sugebėjo keliems kūdikiams, dėl genų defekto neturintiems imuninės sistemos, ją atkurti, pakeitę brokuotus genus veikiančiais. Šis naujas, bet sudėtingas gydymo metodas – genų terapija, kartais jau duoda tiesiog stebuklingų rezultatų.
Naudojami modifikuoti virusai, kurie it paštininkai atgabena į žmogaus ląstelę teisingai veikiantį geną ir jį įklijuoja tinkamoje genomo vietoje. Deja, neretai toks virusas pažadina leukemiją sukeliančius genus arba išprovokuoja ūmias organizmo reakcijas.
Genų terapijos metodus tobulina ir mūsų šalies mokslininkai, pelnę Lietuvos mokslo premiją. Jie tiria ir kuria baltymus, labai padidinančius genų terapijos efektyvumą. Beje, šie baltymai gyvybiškai svarbūs ne tik žmonėms, bet ir bakterijoms.
„Ne visi žino, kad yra virusų, puolančių pačias bakterijas. Tie virusai vadinami fagais. Jeigu žmogui susidūrimas su virusais baigiasi sloga, bakterijai tai baigiasi ląstelės žūtimi. Todėl bakterijos išrado daug būdų apsisaugoti nuo virusų infekcijų. Jos stabdo paties viruso prisijungimą prie ląstelės, viruso genetinės medžiagos patekimą į ląstelę. Jeigu genetinė viruso medžiaga patenka į bakterijos ląstelės vidų, yra bent kelios sistemos, kurios tą viruso DNR sukarpo“, – sako Lietuvos mokslo premijos laureatas dr. Giedrius Sasnauskas iš VU Biotechnologijos instituto.
Mokslininkų tyrimų objektas – gamtos ir evoliucijos išradimas
Kadangi fagai gali daugintis tik ląstelėje, jie kinta, ieškodami būdų, kaip įveikti ląstelių gynybos barjerus, o bakterijos kuria vis naujas ar modifikuoja turimas apsaugos sistemas. Šių „ginklavimosi varžybų“ dėka nusistovėjo pusiausvyra – aplinkoje ir mūsų žarnyne apstu bakterijų bei jas puolančių bakteriofagų.
Teigiama, kad vienai bakterijai tenka daugiau nei po penkis virusus. Todėl fagai yra gausiausia gyvybės forma. Jeigu ląstelė visgi užsikrėtė, kitos vidinės apsaugos sistemos ją numarina, kad įsiskverbę virusai nespėtų pasidauginti. Didvyriška vienos ląstelės žūtis išgelbsti likusias.
Baltymai, vadinami antrojo tipo restrikcijos endonukleazėmis – vienas iš efektyviausių ir seniausiai atrastų ginklų, kuriuos naudoja bakterijos. Būtent šis gamtos ir evoliucijos išradimas yra mokslininkų tyrimo objektas.
„Restrikcijos endonukleazės – fermentai, kuriuos dažnai vadina molekulinėmis žirklėmis. Jos atpažįsta tam tikrus DNR fragmentus – taikinius, susidedančius iš trumpų nukleotidų ir ties jais perkerpa DNR. Šitaip jos saugo bakterijų ląsteles nuo virusų“, – LRT Televizijos laidai „Mokslo ekspresas“ sako G. Sasnauskas.
Virusams tai – sunkiai įveikiama kliūtis. Antrojo tipo restrikcijos endonukleazės karpo DNR grandinę įvairiose vietose, o sukarpytus genetinės medžiagos fragmentus po to galima sujungti, naudojant kitus baltymus. Tokios molekulinės žirklės ir klijai – tai pagrindiniai genų inžinerijos instrumentai.
„Genų inžinerija – tai genetinės informacijos karpymas ir lipdymas, pertvarkymas pagal mūsų poreikius. Kad būtų galima genus koduojančius baltymus perkelti iš vieno organizmo į kitą. Priverčiant bakterijas sintetinti žmogui būtinus baltymus, pradedant insulinu ir kitais vaistiniais preparatais. Genų inžinerijos atsiradimą nulėmė restrikcijos endonukleazių atradimas“, – aiškina G. Sasnauskas.
Trijų Lietuvos mokslininkų kartų indėlis
Šis genetinės inžinerijos metodų atsiradimas sukėlė revoliuciją biomedicinos tyrimuose, biotechnologijų pramonėje ir medicinoje. Jie leidžia greitai ir tiksliai pertvarkyti genetinę informaciją įvairiose mikroorganizmų, gyvūnų ar augalų ląstelėse: karpyti ir jungti įvairius baltymus koduojančius DNR fragmentus pagal mūsų poreikius, taip pat perkelti juos iš vieno organizmo į kitą. Atsirado naujų diagnostikos ir gydymo būdų, prasidėjo genetiškai modifikuotų organizmų kūrimo bumas.
Bakterijų atsparumo virusams reiškinys buvo atrastas XX amžiaus šeštajame dešimtmetyje. Tokią efektyvią apsaugos sistemą sudaro du kartu veikiantys fermentai: jau minėta endonukleazė ir metiltransferazė. Pastaroji apsaugo šeimininko DNR nuo molekulinių žirklių, ją savaip pažymėdama. Bet jei į ląstelę pakliūva svetima nukleorūgštis, ji kaip mat atpažįstama ir sukarpoma. Taip ir stabdomas viruso dauginimasis.
„Šie molekuliniai mechanizmai, kai vienas fermentas modifikuoja, o kitas karpo, buvo atrasti aštuntojo dešimtmečio pradžioje. Atradimas buvo įvertintas Nobelio premija. Pastebėjus, kad yra fermentai, kurie gali tam tikrose vietose karpyti DNR, netrukus buvo sugalvota, kaip juos panaudoti. Atsirado genų inžinerija ir tos REN tebėra vienu iš pagrindinių įrankių daugelyje molekulinės biologijos laboratorijų“, – tvirtina G. Sasnauskas.
Tokių fermentinių karpymo-modifikavimo sistemų tyrimai Lietuvoje turi gilias tradicijas, kurias sėkmingai tęsia trečioji tyrėjų karta. Lietuvos mokslo premija už darbus šioje srityje pirmasis 1994 metais įvertintas akademikas Arvydas Janulaitis, 2001 metais – profesoriai Saulius Klimašauskas ir Virginijus Šikšnys. Šių metų premijos laureatai yra buvę prof. V. Šikšnio doktorantai.
„VU Biotechnologijos institute prieš 40 metų buvo įkurtas taikomosios enzimologijos institutas. Vienas iš tame institute vykdytų darbų buvo REN paieška. Šie darbai leido atsirasti vienai sėkmingiausių aukštųjų technologijų įmonių Lietuvoje – „Fermentui“, – „Mokslo ekspresui pasakoja G. Sasnauskas.
Didelė šių naudingų baltymų paklausa lėmė intensyvias jų paieškas. Šiuo metu pasaulyje aprašyta virš 4 tūkst. fermentų, atpažįstančių daugiau nei 300 skirtingų DNR sekų. Lietuvos mokslininkai yra suradę net trečdalį jų.
„Seniau REN jų būdavo ieškoma įvairių bakterijų kamienuose. Tiesiog iš aplinkos, iš įvairių šaltinių buvo surenkamos bakterijos, kultivuojamos. Paimami DNR fragmentai, jie karpomi su tais išskirtais baltymais iš ląstelių ir žiūrima, kaip ta DNR sukarpoma“, – teigia G. Sasnauskas.
Šiuo metu naudojami efektyvesni paieškos metodai. Nemažai DNR karpančių fermentų surandama, analizuojant iššifruotą bakterijų genomą. Kitas kelias – modifikuoti žinomus baltymus, tokiu būdu pakeičiant jų specifiškumą, t.y. iš esmės sukurti naują fermentą.
„Įprastiniu atveju REN perkerpa dvigrandinę DNR. Įprastai REN kerpa abi grandines. Tačiau yra keletas būdų paversti tokias REN paversti vieną grandinę kerpančiu fermentu. Tokie fermentai vadinami nikazėm. Tai – platesnio panaudojimo sulaukiantys molekuliniai įrankiai“, – aiškina G. Sasnauskas.
Norint modifikuoti tokius sudėtingus baltymus, reikia gerai pažinti jų struktūrą ir suprasti veikimo mechanizmus. Iki šiol tokie tyrimai gerokai atsiliko nuo pačių baltymų paieškos. Premija įvertinti darbai ir buvo skirti nuodugniems nukleazių tyrimams.
„Baltymo struktūros nustatymui naudojami įvairūs metodai. Antai branduolio magnetinis rezonansas, elektronine mikroskopija paremti metodai, taip pat rentgenostruktūrinė analizė. Mūsų institute baltymų struktūrų nustatymui naudojama rentgenostruktūrinė analizė. Bendradarbiaudami su kitų laboratorijų mokslininkais, nustatėme keliolika šių baltymų struktūrų, kurios sudaro apie trečdalį visų pasaulyje žinomų REN struktūrų“, – aiškina Lietuvos mokslo premijos laureatas dr. Gintautas Tamulaitis.
Struktūros nustatymas – tai baltymo, susijungusio su DNR trimatis vaizdas, kurio skiriamoji geba siekia 1.5–2.5 Å. Toks vaizdas leidžia suprasti baltymo sąveikos su DNR mechanizmus. Taip buvo pastebėti ir ištirti nauji sąveikos su DNR būdai. Todėl mokslininkai galėjo pasiūlyti naujus metodus, kaip konstruoti DNR nikazes – vis plačiau genų inžinerijoje naudojamus fermentus, įkerpančius tik vieną DNR grandinę.
Kai kurie tokie fermentai prieš kirpdami netgi sugeba šiek tiek deformuoti DNR – moksliškai kalbant, išsukti išorėn bazių porą. Šis naujas DNR atpažinimo mechanizmas ištirtas, naudojant moderniausius biocheminius, spektroskopinius ir rentgenostruktūrinės analizės metodus. Kai kurios baltymų molekulės buvo stebimos kartu su JAV, Japonijos, Olandijos mokslininkais, naudojant atominės jėgos mikroskopą.
„Galime stebėti baltymo ir ilgų DNR kompleksus. Stebėdami baltymo ir DNR sąveiką tirpale matome, kaip baltymo molekulė susiriša su DNR molekule, suranda savo taikinį ir ją hidrolizuoja. Naudojant didelio greičio atominės jėgų mikroskopiją, galima nufilmuoti baltymo-DNR sąveiką“, – sako G. Tamulaitis.
Taigi nukleazių pasaulis pasirodė esantis žymiai įdomesnis ir įvairesnis, nei manyta anksčiau. Pavyzdžiui, paaiškėjo, kad jos priklauso penkioms baltymų šeimoms. Tai reiškia, jog bakterijos, milijonus metų kovodamos su bakteriofagais, restrikcijos fermentus „išrado“ mažiausiai penkis kartus. Neveltui sakoma, kad būtinybė yra išradingumo motina.
„Kadangi dabar suprantame šių fermentų įvairovę, žinome jų veikimo mechanizmą, galime pasiūlyti metodus, kaip praplėsti jų specifiškumą ir sukurti naujus molekulinius įrankius, kuriuos galima naudoti genų terapijai“, – LRT Televizijos laidai „Mokslo ekspresas“ aiškina G. Tamulaitis.
Su šaknimis išraus ir vėžį
Genų terapijos esmė paprasta – siekiama žmogaus ląstelėse ligą sukeliantį mutavusį arba tiesiog „sugedusį“ geną pakeisti geru. Antai su šaknimis išrauti krūties vėžį sukeliantį geną. Norint tą pasiekti, naudojamasi ląstelėje natūraliai vykstančiu DNR pažaidų taisymo procesu – homologine rekombinacija. Jos dėka blogą geną įmanoma pakeisti geru, į ląstelę atgabenus teisingą DNR fragmentą su gero geno seka. Tačiau tokio įvykio tikimybė labai maža.
„Natūraliai homologinė rekombinacija vyksta tik vienoje iš milijono ląstelių. Tačiau ši tikimybė gali būti padidinta apie 100 tūkst. kartų, jeigu blogo geno vietoje genome bus įvestas dvigrandininis trūkis. Būtent tokioms precizinėms genomo operacijoms ir stengiamasi pritaikyti patobulintas REN, kuris kirptų savo taikinį greta blogo geno, bet nepaliestų likusio žmogaus genomo“, – pasakoja Lietuvos mokslo premijos laureatas dr. Mindaugas Zaremba.
Kuriant patobulintas endonukleazes tokioms genomo operacijoms atlikti, siekiama prie fermento prijungti papildomą su DNR sąveikaujantį modulį. Tuomet tokia hibridinė endonukleazė atpažintų pailgintą DNR taikinį. Pagrindinis iššūkis – priversti ją įkirpti tik konkretų taikinį greta blogo geno, nepaliečiant likusio žmogaus genomo.
„Savo darbuose eksperimentiškai pademonstravome keletą strategijų, dėl kurių patobulintos REN kerpa tik adresuotus DNR taikinius. Šiuo metu pasaulyje bandoma sukurti fermentus, kurių aktyvumas būtų reguliuojamas išoriniu signalu, pavyzdžiui, šviesa. Tuomet, pristačius tokias REN į ląstelę, norimu metu mes galėtume jas įjungti, o atlikus genomo operaciją, išjungti“, – teigia M. Zaremba.
Gydymo procesas susideda iš dviejų etapų: paruošiamas operacijos laukas, o tuomet įterpiamas atgabentas genas.
„Tai – du procesai, bet jie dažnai derinami vienu metu. Pristatomas ir instrumentas, ir DNR seka su gero geno seka. Atsidūrę toje ląstelėje, vienas jų perkerpa reikiamoje vietoje žmogaus genomą, o kitas padeda šalia esančią DNR su gera seka įstatyti į tą įkirpimą“, – sako M. Zaremba.
Genai – universalūs instrumentai
Genų terapijai jau ne vienerius metus naudojami kelių tipų virusai. Deja, ne visada juos pasiseka suvaldyti, kad neprikrėstų eibių. Todėl, nors dar neatsisakoma virusinių nešėjų, mieliau naudojami dirbtiniai nešėjai, vadinami transfekcijos agentais.
Iš jų suformuojamos pūslelės, į kurias įterpiami operacijai būtini baltymai-žirklės kartu su geru genu. Pasiekusios tikslą, pūslelės susilieja su ląstelės membrana ir jos turinys pakliūva į ląstelės vidų. Operacija prasideda.
„Šiuo metu pasaulyje naudojama įvairios genomų taisymui skirtos endonukleazės. Antai hibridinės. Dabar itin susidomėta naujai atrastomis bakterijų apsaugos sistemomis, vadinamomis CRISPR. Jos labai universalios ir gali būti lanksčiai pritaikomos atakuoti skirtingas genomo vietas“, – „Mokslo ekspresui“ pasakoja M. Zaremba.
Problema ta, kad norint pagydyti vieną ar kitą ligą, reikia atakuoti įvairius taikinius. Todėl atpažinimo procedūrą šioje sistemoje atlieka ne baltyminė dalis, kurią gana sunku pakeisti. CRISPR sistemoje už atpažinimą atsakinga RNR. O norimą jos seką susintetinti gana paprasta.
2015 metų pradžioje mokslininkai iš Johno Hopkinso medicinos mokyklos JAV sukūrė ir sėkmingai išbandė iš polimerų sukurtas nanodaleles. Kai kurios jų labai efektyviai perneša į žiurkės smegenų vėžines ląsteles DNR fragmentą, koduojantį geną – Herpes simplex viruso 1 tipo timidino kinazę kartu su junginiu ganciclovir.
Toks žudantis rinkinys, pasiekęs tikslą, sunaikina gliomos ląsteles. Atrodo, kad mokslininkų rankose genai tampa vis labiau universaliais instrumentais.
